После того как получены вектор и вставка, можно приступать к конструированию рекомбинантных ДНК. Обычно нужно осуществить только два двухцепочечных соединения независимо от того, представляет ли собой вектор линейную плазмиду или вирусный геном или два плеча ДНК фага X объединены в одну линейную молекулу по cos-сайтам. Если вставки имеют тупые концы, то перед лигированием для его облегчения к ним часто присоединяют липкие концы.

а. Соединение концов

Рассмотрим четыре возможные ситуации: вектор и вставка имеют полностью совпадающие липкие концы; две разные пары совпадающих

концов; тупые концы; пару совпадающих липких и пару тупых концов. Структура вектор-вставка, в которой каждый из компонентов содержит один липкий и один тупой концы, может образоваться только одним способом. То же самое относится к случаю, когда вектор и вставка имеют по два разных совпадающих липких конца. В тех же случаях, когда каждая молекула имеет два идентичных липких конца или два тупых конца, вставка может быть встроена в любой из двух возможных ориентации относительно вектора, в результате чего образуются два разных продукта. Липкие концы вектора и вставки соединяют с помощью ДНК-лигазы в условиях, способствующих образованию водородных связей между комплементарными участками. Для объединения тупых концов ДНК-лигаза Т4 и фрагменты должны присутствовать в высоких концентрациях, поскольку лигаза имеет низкое сродство к тупым концам.

Помимо лигирования вектора и вставки может происходить внутримолекулярное лигирование этих двух компонентов, в результате чего выход ре-комбинантных молекул снижается. Вероятность таких побочных реакций можно уменьшить, проводя перед лигированием дефосфорили-рование либо вектора, либо вставки. В отсутствие 5'-фосфомоноэфирных групп внутримолекулярное лигирование осуществляться не может. Обычно дефосфорилируют векторную молекулу, чтобы свести к минимуму ее способность к амплификации после трансфекции. Вставка, замкнувшаяся в кольцо, не способна к репликации, поэтому с ней возникает меньше проблем. Рекомбинантная молекула, образовавшаяся из дефосфорилированной векторной молекулы, содержит по одному пробелу в каждой из цепей. Такие молекулы легко репарируются в клетках соответствующих хозяев.

б. Присоединение липких концов

Встраивание сегментов ДНК в векторные молекулы облегчается, если эти сегменты и вектор имеют одинаковые липкие концы. Существуют два удобных способа образования липких концов у сегментов ДНК с тупыми концами: образование одноцепочечных "хвостов" и введение сайтов рестрикции.

Образование одноцепочечных "хвостов". Если с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы нарастить каждый из 3'-гидроксильных концов двухцепочечной вставки с тупыми концами и присоединить комплементарные нуклеотиды к концам линейной векторной ДНК, то при отжиге образуется кольцевая рекомбинантная молекула. Если размер "хвостов" одинаков, то концы легко сшиваются ДНК-лигазой. Однако такая ситуация встречается редко, поэтому перед лигированием бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы I. Напомним также, что для терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы требуются одноцепочечные З'-гидроксильные концы в качестве праймеров и что для эффективного наращивания дуплексных молекул ДНК с тупыми концами или молекул, у которых З'-гидроксильные концы заглублены, необходимы особые условия.

Введение сайтов рестрикции. Короткие фрагменты ДНК с тупыми концами, содержащие последовательности с сайтами для специфических рес-триктирующих эндонуклеаз, получают путем химического синтеза. Структуры двух таких "линкеров" и способ получения с их помощью липких концов у вставки с тупыми концами. Соединение линкера со вставкой катализируется Т4-лигазой. Затем эту ДНК обрабатывают соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой, чтобы получить липкие концы. На этом последнем этапе возникают проблемы. Если фрагмент, к которому присоединены линкеры, содержит сайт узнавания для используемого фермента, то образование липких концов приводит к нарушению целостности фрагмента. Эту проблему можно решить двумя способами. Первый состоит в использовании другого линкера. Второй основан на защите внутренних сайтов путем метилирования с помощью метилазы, специфичной в отношении данного сайта.

Прочие статьи:

Биофизические основы зрительной рецепции
Зрение включает поглощение энергии излучения и превращения ее в нервный импульс. Основа механизма зрения стала хорошо известна в результате работ Уоада и других (Wald G, 1968 год). Как и в фотосинтезе, первичной стадией является поглощен ...

Понятие биохимической индивидуальности человека
Биохимическая индивидуальность - индивидуальность (неповторимость) состава, процентного соотношения и активности разнообразных биологически-активных веществ и соединений в организме человека (белков, ферментов и гормонов и т.п.). ...

Микрофлора почвы
Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов в природе, которые принимают активное участие в процессах формирования и самоочищения почвы, а также в круговороте веществ в природе (азота, углерода, серы, ...