Возможность проведения шотган-экспериментов рассматривалась еще тогда, когда технология рекомбинантных ДНК делала свои первые шаги. Идея амплификации очень сложных смесей фрагментов ДНК и последующего обнаружения одного из них казалась фантастичной, а сейчас она представляется почти банальной. Основной принцип этого подхода состоит в создании коллекции рекомбинантных молекул, составляющих полный геном данного организма. По существу, полный нефракционированный набор фрагментов ДНК превращают в соответствующий набор стабильных рекомбинантов, который можно сохранять и многократно использовать для клонирования различных вставок. При этом применяются Е. сой-системы хозяин-вектор, где в качестве вектора используются плазмиды или бактериофаги, поскольку они более пригодны для получения большого числа рекомбинантных молекул и удобны для хранения.

Наиболее важны два типа библиотек. Одна из них, создаваемая из суммарной геномной ДНК, в принципе должна содержать все гены данного организма. Однако такая цель обычно оказывается недостижимой, поскольку некоторые последовательности ДНК не удается клонировать. Один из вариантов геномной библиотеки представляет собой всю ДНК какой-то одной хромосомы. Для создания такой библиотеки необходимо выделить ДНК из отдельных хромосом. Хромосомы человека фракционируют с помощью методов, аналогичных используемым при сортировке флуоресцирующих и нефлуоресцирующих клеток. Метод основан на разной эффективности связывания флуоресцирующих красителей с хромосомами, которая зависит от размера хромосом и GC-содержания ДНК. Раствор окрашенных хромосом пропускают с высокой скоростью через узкое отверстие, на которое сфокусирован пучок света, испускаемого лазером. Хромосомы поочередно пересекают этот пучок, который индуцирует их специфическую флуоресценцию. Детектор определяет интенсивность флуоресценции и изменяет направление движения тех хромосом, интенсивность флуоресценции которых превышает заданную величину, таким образом, что они попадают в специальный коллектор. Изменяя этот заранее установленный уровень интенсивности флуоресценции, можно отбирать разные хромосомы.

Отдельные хромосомы дрожжей и некоторых простейших невозможно идентифицировать цитогенетическими методами, однако ДНК из них все же удается выделить. Для выделения применяют мягкие методы, чтобы избежать разрыва молекул. Затем ДНК подвергают электрофорезу в агарозном геле в условиях, позволяющих разделить молекулы длиной до 2000 т.п. н. Традиционные методы электрофореза не позволяют разделять дуплексные молекулы, размер которых значительно превышает 20 т.п. н. Скорость миграции столь больших молекул уже не зависит от их размера. Однако если вместо постоянного однонаправленного электрического поля, приложенного к обычному гелю, использовать поле, ориентация которого многократно меняется, то даже очень большие молекулы можно будет разделить по размерам. По-видимому, этот феномен объясняется механизмом прохождения молекул ДНК через поры агарозного геля. Предполагается, что молекулы вытягиваются в направлении поля, а затем при изменении этого направления переориентируются. Время переориентации зависит от длины цепи и угла между направлениями поля; они и определяют конечное расстояние, на которое перемещается молекула. В простейшем варианте импульсного электрофореза электрический ток подается импульсами, при этом направления поля примерно перпендикулярны друг другу, а само поле неоднородно. При более сложных распределениях используют однородные поля и оптимизируют угол между двумя направлениями, с тем чтобы повысить разрешение. Импульс обычно длится примерно минуту.

Библиотеки второго типа включают последовательности, составляющие всю мРНК, обнаруживаемую в определенных клетках. В этом случае популяцию мРНК превращают в популяцию молекул кДНК, которые затем клонируют. Геномные библиотеки представляют собой собрание генов и последовательностей ДНК; в библиотеках кДНК представлены продукты экспрессии этих генов в форме мРНК.

а. Геномные библиотеки

Геномные библиотеки обычно создают с помощью векторов, сконструированных на основе бактериофага X или космиды. Эти векторы содержат большие вставки, благодаря чему минимизируется число рекомбинантов, наобходимых для составления библиотеки. Например, если создается Х-библиотека генома млекопитающего, содержащего 3*109 п. н. при средней длине вставки 17 т.п. н., то весь геном будет представлен 3* 109/1,7* 104 = 1,8* 105 рекомбинантами. На самом деле для создания библиотеки, вероятность обнаружения в которой определенного сегмента генома превышает 99%, нужно получить ~ 106 отдельных рекомбинантных молекул, поскольку лигирование отдельных фрагментов происходит случайно. Так, некоторые фрагменты могут быть включены более чем в одну векторную молекулу, а другие могут вообще не участвовать в лигировании и упаковке. Полная космидная библиотека содержит меньше рекомбинантных молекул, поскольку размер вставок может достигать 45 т.п. н.

Прочие статьи:

Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул
а. Обнаружение нужного клона После разделения рекомбинантных молекул и получения отдельных клонов встает трудно разрешимая задача-обнаружение нужного клона или клонов. Идентификация клона основывается на том, что вставка в рекомбинантной ...

Тканеспецифичные стволовые клетки
Полагают, что стволовые клетки важны для регенерации нескольких взрослых тканей. В последнее время были идентифицированы взрослые стволовые клетки с очень широким потенциалом дифференцировки, хотя не известно представляют ли они примитивн ...

Бесполое размножение
Бесполое размножение, или агамогенез — форма размножения, при которой организм воспроизводит себя самостоятельно, без всякого участия другой особи. Следует отличать бесполое размножение от однополого размножения (партеногенеза), который я ...