С помощью флуоресцентной микроскопии возможно определение
содержания витаминов
в образцах, благодаря их собственной флуоресценции и с применением флуорохромов. Во многих случаях этот метод даёт лучшие результаты, чем самый тонкий химический анализ, не позволяющий, например, судить о распределении витаминов в органах и тканях. В связи с этим метод особенно широко применяется в медицине и физиологии животных.
Витамин А характеризуется светло-зелёной быстро затухающей флуоресценцией. Её можно наблюдать в свежем нефиксированном виде, но более плодотворным является метод окраски тканей с помощью флуорохромов. Флуоресцентное микроскопирование в данном случае может служить методом дифференциации витаминов А1 и А2: витамин А1 даёт характерную светло-зелёную флуоресценцию, а витамин А2 – красноватую. Различие в интенсивности флуоресценции с успехом используется для анализа смеси свободного витамина А и его эфиров.
Витамин В2 обладает собственной зелёной флуоресценцией (в некоторых животных клетках обнаружена так же жёлто-зелёная флуоресценция). Оптимум люминесценции данного вещества находится при рН от 3 до 9, что необходимо учитывать при проведении исследований. Типичная флуоресценция рибофлавина зависит от присутствия свободной 3-аминогруппы. Эта флуоресценция (максимум на 565 нм при рН 60) служит для количественного определения витамина В2. Интенсивность флуоресценции сравнивается с каким-либо стандартом (чаще всего чистый рибофлавин), она прямо пропорциональна содержанию витамина.
Витамин В1 не флуоресцирует ни в чистом виде, ни в водном растворе. Способность к сине-зелёной флуоресценции проявляет тиамин только в комплексе с носителем. При окислении витамин В1 превращается в тиохром – жёлтое вещество с интенсивно синей флуоресценцией. В щёлочном растворе тиохром очень чувствителен к свету и флуоресценция его исчезает необратимо. Свойством витамина В1 окисляться в тиохром пользуются в тесте на этот витамин: водный раствор тиамина окисляется посредством железосинеродистого калия в тиохром, флуоресценция которого определяется фотоэлектрически после экстракции тиохрома изобутиловым спиртом. Интенсивность флуоресценции зависит от щёлочности раствора и количества находящегося там тиохрома. Результаты, получаемые этим методом, находятся в полном соответствии с биологическими тестами.
Никотиновая кислота и её амид так же связаны с коллоидальным носителем. Амид никотиновой кислоты присутствует в двух коферментах: кодегидраза-1 и кодегидраза-2. Кодегидраза-2 встречается практически во всех живых клетках. Свойства его очень близки к свойствам кодегидразы-1: оба вещества бесцветны, растворимы в воде, нерастворимы в органических растворителях. Эти носители дают хорошую флуоресценцию при освещении в УФ-свете, что используется для их определения.
Витамин С в водном растворе не флуоресцирует. Только при большой концентрации аскорбиновой кислоты с коллоидным носителем появляются зелёные, довольно лабильные по отношению к ультрафиолетовым лучам капли.
Витамин К даёт типичную адсорбцию с максимумом при 234, 248, 261, 270 и 320 нм (в ультрафиолетовой области). Витамин К обладает белой флуоресценцией в свете аргоновой лампы. Н.А. Андреев и В.Н. Букин (1949) разработали количественный флуоресцентный метод определения фолиевой кислоты в клетках. Ими построена кривая распределения интенсивности в спектре флуоресценции кислоты, показано изменение интенсивности в спектре флуоресценции кислоты, показано изменение интенсивности свечения в зависимости от рН раствора. Описан метод экстрагирования кислоты, её адсорбции на активированном угле (обработанном анилином) с последующим элуированием спиртом: полученный раствор упаривают и окисляют перманганатом. Измерение интенсивности флуоресценции авторы проводят при рН 4,0-4,5, пользуясь светофильтром (470 нм), применяя в качестве стандарта раствор фолиевой кислоты концентрации 2 мл в 100 мл воды. Для полного извлечения фолиевой кислоты необходимо подвергать дополнительной ферментативной обработке продукты, которые содержат много белковых веществ. [1,3]
Прочие статьи:
Плоды и семена
После оплодотворения стенки завязи претерпевают глубокие изменения, одревесневают или становятся мясистыми, они образуют плод (или околоплодник, семенник), в то же время развиваются и семязачатки. Накапливая запас питательных веществ, они ...
Опытно – экспериментальная часть.
Абиотический синтез биомономеров
Синтез аминокислот при действии электрических разрядов в газовой смеси, имитирующей возможный состав примитивной земной атмосферы, был осуществлен еще в 1953 г в широко известных в настоящее время опытах Миллера. Использованный для этой ц ...
Вирус как живая система
Глубокие различия между клеточными организмами и вирусами привели к разным толкованиям природы вирусов. Если живая природа любых клеточных организмов ни у кого не вызывает сомнения, то на вопрос о том, являются ли живыми вирусы, различные ...