Вставки
Страница 2

Идентификация специфических фрагментов. Проблемы, возникающие при идентификации фрагментов. При расщеплении примерно 50 мкг геномной ДНК и последующем электрофорезе препарата масса сегмента ДНК длиной 1000 п. н., встречающегося в геноме лишь один раз, составляет всего 17*10-6 мкг, или 17 пг. Как идентифицировать этот специфический фрагмент? Если имеется гомологичная ДНК или препарат комплементарной РНК, которые можно использовать в качестве зонда при гибридизации, то интересующий нас фрагмент можно обнаружить при отжиге зонда с фрагментами после их денатурации. Так, в качестве зонда можно использовать очищенную мРНК, соответствующую гену, который мы хотим клонировать. Иногда в роли зонда выступает гомологичный ген, клонированный в другом организме и имеющий достаточно близкую структуру. Чтобы выявить гибрид, нужно использовать меченый зонд. Чаще всего его метят радиоактивным изотопом.

Определив примерный размер интересующего нас фрагмента, можно элюировать материал соответствующей области другого геля, не прошедшего гибридизацию, и использовать этот материал для клонирования. Аналогичным образом можно тестировать фракции после хроматографического разделения фрагментов на колонке.

Блоттинг. Почти во всех случаях, подобных описанным выше, ДНК перед гибридизацией переносят с геля на более подходящую подложку. Этот метод широко используется, например, для идентификации специфических РНК и белков после их электрофоретического разделения. Блоттинг ДНК назван по имени его изобретателя блоттингом по Саузерну; соответствующие методики для РНК и белков получили название нозерн-блоттинга и вестерн-блоттинга.

Гибридизация меченого зонда с фрагментами ДНК, находящимися в геле, происходит очень неэффективно. Поэтому перед отжигом фрагменты переносят из геля на более подходящую твердую подложку, обычно на нитроцеллюлозный фильтр или нейлон. Сначала гель обрабатывают щелочью, чтобы произошла денатурация ДНК. Затем на него накладывают твердую подложку и пропускают через гель буферный раствор. В результате фрагменты ДНК переходят на подложку с сохранением их взаимного расположения. Далее инкубируют подложку в растворе, содержащем 32Р-зонд, при такой ионной силе и температуре, которые обеспечивают образование водородных связей между зондом и комплементарным фрагментом ДНК. Чувствительность метода зависит от удельной радиоактивности зонда и позволяет зарегистрировать фрагменты, когда их количество измеряется пикограммами. Например, 32Р-меченные зонды, полученные с помощью ник-трансляции, имеют удельную радиоактивность более 100 имп. /мин на 1 пг, что достаточно для визуализации радиоавтографов.

Случайная фрагментация геномной ДНК. Длинные молекулы ДНК легко ломаются даже при незначительных гидродинамических напряжениях, и их можно подвергнуть случайной фрагментации с помощью ультразвука, путем быстрого перемешивания раствора или пропускания его через небольшое отверстие. Для получения случайного набора перекрывающихся фрагментов можно использовать и рестриктирующие эндонуклеазы, если проводить опыт в таких условиях, когда расщепление происходит лишь в небольшом числе имеющихся сайтов. Средний размер образующихся фрагментов зависит от величины прикладываемого усилия и от концентрации эндонуклеазы. Обычно ДНК выделяют из большой популяции клеток, поэтому исходные ее препараты всегда представлены большим числом идентичных геномов. Каждый сегмент ДНК присутствует в конечном наборе во фрагментах разных размеров, что не позволяет очистить его перед клонированием. Тем не менее, случайные наборы фрагментов имеют преимущество перед наборами, получаемыми в результате полного гидролиза рестриктирующей эндонуклеазой, поскольку вероятность нахождения хотя бы одной копии нужного сегмента целиком в одном фрагменте у них значительно выше.

Страницы: 1 2 3 4 5 6


Прочие статьи:

Понятие дозиметрии
Дозиметрия - область прикладной физики, в которой изучаются физические величины, характеризующие действие ионизирующих излучении на объекты живой и неживой природы, в частности дозы излучения, а также методы и приборы для измерения этих в ...

Эндогенные механизмы регуляции процесса фотосинтеза
Регуляция фотосинтеза осуществляется на уровне фотохимически активных мембран, хлоропластов, клеток, тканей, органов и целого организма. Все системы регуляции принимают участие в этом процессе. Процессы в хлоропластах при переходе к фото ...

Взаимосвязь охотничьего хозяйства с сельским и лесным
1. Сохранение при рубках лесов особо ценных для охотхозяйства (токов, солонцов, мест концентрации). 2. Согласование мест устройства подкормочных площадок, биотехнических сооружений. 3. Одновременное и совместное проведение заготовок вет ...

Разделы