В качестве зондов можно использовать высоко очищенные мРНК и денатурированные гомологичные ДНК или кДНК. Особенно удобны одноцепочечные зонды, поскольку их не нужно денатурировать и тестируемые клонированные ДНК не конкурируют с другими гибридизующимися цепями ДНК во время отжига. мРНК-зонды уже являются одноцепочечными, а одноцепочечные кДНК-зонды легко получить, скопировав только одну цепь. Одноцепочечные РНК-зонды можно также приготовить из рекомбинантной плазмиды, содержащей последовательность зонда, встроенную в специальный вектор, например pGEM. Этот вектор содержит два разных высокоспецифичных бактериальных промотора, фланкирующих вставку в рекомбинантных молекулах. Используя очищенную соответствующим образом линеаризованную плазмиду в качестве матрицы in vitro и ту или иную из РНК-полимераз прокариот, синтезируют РНК, которая представляет собой копию одной из двух цепей вставки.

Если известна аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого данным геном, то можно восстановить нуклеотидную последовательность этого гена и затем синтезировать его химическими методами. Даже в тех случаях, когда в качестве зонда используется участок ДНК длиной всего 15 нуклеотидов, можно получить относительно достоверный результат. Из-за вырожденности генетического кода невозможно точно восстановить уникальную последовательность кодирующего участка. Чтобы решить эту проблему, синтезируют смесь олигонуклеотидов, различающихся одним или несколькими нуклеотидами. Это не так трудно, как кажется. Вместо того чтобы использовать один защищенный мононуклеотид на определенном этапе химического синтеза, используют смесь защищенных мононуклеотидов.

Тестирование на синтез специфического полипептида in vitro. Иногда не удается провести прямой скрининг клонов потому, что просто отсутствует в достаточной степени очищенный подходящий зонд. В таком случае можно использовать непрямые методы, хотя обычно они неудобны при массовом скрининге клонированных популяций. Большинство обычно применяемых непрямых методов основаны на двух принципах. Во-первых, можно транслировать соответствующую мРНК in vitro и получить идентифицируемый полипептид. Во-вторых, можно использовать тот факт, что трансляция подавляется, если одноцепочечная мРНК ренатурирует с комплементарной клонированной ДНК. РНК, входящая в дуплекс РНК-ДНК, не способна функционировать как мРНК.

Если проинкубировать смесь мРНК in vitro в присутствии необходимых компонентов, то на них синтезируются соответствующие полипептиды. Смесь этих полипептидов можно разделить по размерам с помощью электрофореза. Эффективная трансляция in vitro осуществляется только с одноцепочечных мРНК. Если же до начала трансляции какая-то мРНК ренатурировала с комплементарной ДНК и образовался гибридный дуплекс ДНК-РНК, то информация с этой мРНК не будет считываться. С помощью процедуры, получившей название HART, клонированные рекомбинантные ДНК очищают, денатурируют и отжигают с препаратами мРНК до начала трансляции in vitro. Молекулы ДНК, гомологичные определенному гену, гибридизуются с мРНК, и среди продуктов трансляции не обнаруживается соответствующий полипептид.

Прочие статьи:

Нематода
Нематода - микроскопические черви, также поселяющиеся на корнях кактусов. Бороться с этим вредителем трудно. Обычно обнаружив нематоду, вырезались все пораженные (узловатые) корни и кактус укореняли заново. Сейчас применяется пролив почвы ...

Простые липиды. Ацилглицерины
Наиболее важная и распространенная группа простых нейтральных липидов — ацилглицерины. Ацилглицерины (или глицериды) — это сложные эфиры глицерина и высших карбоновых кислот (табл. 1). Они составляют основную массу липидов (иногда до 95%) ...

История дрожжей
Всю историю тесного общения человека со своими постоянными одноклеточными микроскопическими спутниками - дрожжами можно условно разделить на отдельные периоды. Уже в ХХ веке до нашей эры человек сумел «приручить» дрожжи, даже не зная об ...