Экспрессия эукариотических генов в бактериальных системах хозяин-вектор. Ни фенотипический отбор, ни иммунологический скрининг обычно неприменимы при выделении клеток Е. coli, содержащих определенный рекомбинантный эукариотический ген. Исключение составляют некоторые гены дрожжей и других грибов, способные экспрессироваться в клетках Е. coli. Однако большинство генов эукариот не могут должным образом экспресси-роваться в клетках Е. coli, поскольку они утратили функциональные промоторы и содержат некодирующие участки в составе кодирующих последовательностей. Другое дело, если рекомбинанты содержат кДНК-копии эукариотических мРНК, поскольку некодирующие участки выщепляются во время созревания мРНК в эукариотических клетках. Клетки Е. coli не способны осуществлять такой сплайсинг. В результате кДНК транслируются в правильные полипептиды в Е. coli. Для того чтобы клетки Е. coli смогли обеспечить транскрипцию и трансляцию клонированной эукариотической кДНК, в соответствующие сайты вектора обычно включают Е. сой'-промотор и сигналы трансляции. Подобным же образом, для того чтобы кДНК эукариот могла экспрессироваться в эукариотических клетках, вектор необходимо снабдить соответствующими сигналами регуляции транскрипции. Поскольку в норме геномные регуляторные сигналы обычно находятся вне транскрибируемой части гена, в 5' - или З'-фланкирующем участке, они отсутствуют в мРНК или кДНК.

Другие методы фенотипического скрининга в эукариотических клетках. Фенотипический скрининг редко применяется при работе с диплоидными эукариотическими клетками, поскольку для этого необходима линия клеток, у которых повреждены оба аллеля интересующего нас гена. Идентифицировать трансформированные клетки можно с помощью котрансформации, применяя селективный маркер и соответствующие мутантные клетки или доминантный маркер и клетки, ингибируемые антибиотиком. Однако при этом невозможно различить нужный котрансформант и сопутствующие контрансформированные колонии, содержащие разные рекомбинантные молекулы ДНК. Поэтому обычно скрининг основывается на использовании специфических свойств, проявляемых нужным клоном. В качестве примера можно привести морфологические изменения, наблюдаемые при превращении нормальных клеток в опухолевые, который описан в разделах, посвященных векторам на основе папилломавирусов крупного рогатого скота и ретровирусов. Клетки, трансформированные к онкогенному фенотипу, образуют характерную колонию, или фокус, в отличие от обычных клеток, образующих монослой. Этот метод использовали, например, при отборе рекомбинантов, содержащих клеточные онкогены из геномной ДНК животных.

Другой метод скрининга применяют при клонировании клеток животных, в которых экспрессируется рекомбинантный ген, кодирующий секретируемый полипептид. При этом используют клетки хозяина, в норме не образующие полипептид, и тестируют среду, в которой находятся трансформированные клетки, на присутствие в ней данного полипептида. Если продуктом является гормон, то его присутствие в среде можно обнаружить с помощью какого-либо удобного высокочувствительного биологического метода. Таким же способом были клонированы гены, кодирующие факторы роста, которые стимулируют пролиферацию специфических клеток-мишеней. Если активность полипептида как такового трудно измерить, то используют специфичные к нему антитела. Этот метод непригоден для одновременного скрининга большой популяции клонированных клеток, содержащих разные рекомбинантные молекулы, поскольку для этого пришлось бы проводить слишком много отдельных тестов. Вместо этого смесь трансформированных клеток подразделяют на удобное число отдельных групп и тестируют эти группы. Группу, дающую положительный ответ, снова подразделяют на подгруппы, вновь выделяют позитивную подгруппу, подразделяют ее, тестируют и так далее до тех пор, пока не будет идентифицирован один позитивный клон.

Прочие статьи:

Аскомицетовые дрожжи
К аскомицетам относят дрожжи, половые споры которых формируются эндогенно внутри особых вместилищ - сумок, или асков. В отличие от мицелиальных аскомицетов, большая часть жизненного цикла которых проходит в гаплоидной фазе, а диплоидна то ...

Эволюция отряда приматов в третичном периоде
Продолжительность третичного периода оценивается специалистами в 63 млн. лет; он подразделяется на пять эпох: палеоцен, эоцен, олигоцен, миоцен и плиоцен. Как и большинство других, этот период начался мощными тектоническими движениями, св ...

Исследования К. Линнея
В классической биологии родство организмов, относящихся к разным группам, устанавливали путем сравнения организмов во взрослом состоянии, эмбрионального развития, поиска переходных Ископаемых форм. Современная биология подходит к решению ...